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动物疫苗培养发酵生产
发布时间：
2019-04-28 16:10
来源：
动物细胞的离体培养一直是科学家们十分重视的研究领域。从1907年美国人Harrison将蝌蚪的神经组织体外培养成功以后的近一个世纪里,动物细胞培养在动物病毒研究及疫苗生产中起了非常重要的作用。通过动物细胞的大规模培养,得到了许多极有价值的生物物质,如疫苗、诊断试剂、干扰素和单克隆体等,为人类的健康提供了有利的保障。20世纪80年代后期“组织工程”概念的提出,动物细胞的三维培养又成为了一个重要的研究课题,它使科学家们梦寐以求的目标即体外重建人体组织逐步成为可能。
动物细胞的培养大致有贴壁培养、悬浮培养、微载体悬浮培养等方式。在动物细胞的培养过程中,细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。按照动物细胞的生长要求,具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。
1 搅拌式生物反应器
搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性,因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护,因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害,传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以,动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的,包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。
1.1 供氧方式的改进
一般情况下,搅拌式反应器还常伴有鼓泡,为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感,所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。
笼式供氧(cageaeration)是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种,即气泡用丝网隔开,不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力,以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器,整体呈梨形,搅拌置于反应器底部,在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡,丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。
Gelligen反应器是美国NBS公司(NewBrunswick Scientific Co.)生产的适合于微载体系统的细胞反应器。反应器中有一个中空的导向搅拌桨,培养液和细胞通过中空导向桨形成上下循环。反应器采用笼式供氧,溶于液体中的氧依靠丝网外液体的对流作用均匀分布到反应器内。该反应器还带有一个气体调节系统,用来控制溶氧浓度和pH值。由于气泡不与细胞直接接触,所以通气量不受限制,而且泡沫少不需用消泡剂,细胞在循环过程受到的剪切力也很小。华东理工大学生化工程研究所开发的CellCul-20动物细胞培养反应器,主要工作原理与Gelligen反应器相似,但采用了双层笼式供氧,提高了氧的传递系数。在20L的反应器中采用灌流工艺培养Vero细胞,连续培养5天细胞数增加37倍,密度超过1×107个/mL。
还有其他一些改进的供氧方式。Lavery等用一个带有双层搅拌的反应器测量了动物细胞培养介质中氧的传递。搅拌轴是中空的,气体从轴的底部通入,经下层桨叶搅拌,均匀地分散于液体中：上层桨叶抑制了液面处气泡的迸溅,从而减小了对细胞的损害。
Sucker等介绍了一种带搅拌的鼓泡反应器,能在动物细胞的培养中将气泡对细胞的损害降到最小。反应器中央液面下方有一个气液混合管,里面装有鼓泡器和搅拌器。液体与鼓泡器出来的气体在混合管内逆流混合,然后在搅拌桨的作用下流出混合管在反应器内形成循环。他们设计了3种不同形式的混合管,目的是为保证混合管内的气泡只能浮于管口而尽可能不进入培养液。实验中在2.4L反应器中的培养效果与100mL的spinner瓶相近。
1.2 搅拌桨的改进
搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大,这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。Kaman等对搅拌桨的形式作了改进,并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨(helicalribbon impeller),顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°,垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力,实验中用于昆虫细胞的培养,最终的培养密度达到6×106个/mL,成活率在98%以上。
2 非搅拌式生物反应器
搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大,容易损伤细胞,虽然经过各种改进,这个问题仍很难避免。相比之下,非搅拌式反应器产生的剪切力较小,在动物细胞培养中表现出了较强的优势。
2.1 填充床反应器
填充床(packed bed)是在反应器中填充一定材质的填充物,供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供,并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带,因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小,适合细胞高密度生长。
Park等人在由填充床反应器和外循环装置构成的连续流动的培养系统中培养动物细胞。反应器中的填料是带有微孔的陶瓷珠粒,细胞在微孔内生长,同时培养液也可以在孔内扩散。实验证明该反应器适于动物细胞的高密度培养,细胞终期密度达到了5×108个/mL。
Chiou等人在以聚氨酯和纤维素泡沫为填料的填充床反应器中培养昆虫细胞,证明这两种微孔材料适合昆虫细胞的生长且不易脱落。在两类填充床中高密度培养的细胞其最终平均密度达到了4.3×107和5.2×107个/mL。
John等在以玻璃纤维作环形填料的气升式填充床反应器中模仿鼠类骨髓细胞生长环境培养细胞,证明这类反应器可以用于动物细胞的大规模培养。Cong等人用微载体培养提供种子细胞,也在填充床反应器中成功实现了CHO细胞的大规模培养,最大细胞密度达到了2×107个/mL。
2.2 中空纤维反应器
中空纤维反应器(hollow fiber bioreactor)由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成,每根中空纤维管的内径约为200μm,壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散,动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。
John等报道了一个用于大规模培养动物细胞的径向流中空纤维反应器。该反应器内有一个垂直的中央分配管,外面由中空纤维管与分配管呈平行组成一个环状床层。培养液由中央分配管径向流过中空纤维床,细胞在中空纤维外壁贴附并生长。空气和CO2的混合气体在中空纤维间与培养液成错流流过床层,向细胞提供氧分并维持一定的pH值环境,细胞的代射物随气流带出。在这个反应器中细胞生长的表面密度可达7.3×106个/cm2。
Guinn发明了一个可用于动物细胞培养的生物反应装置,由中空纤维反应器和灌流系统组成。液体通过泵在反应系统内循环,灌流系统补充或置换培养介质及移出代谢物。细胞在中空纤维膜的一侧生长,培养介质在膜的另一侧通过扩散向细胞传递营养。该反应器能为细胞提供一个温和的生长环境。
Gebhard的发明也是一个用于动物细胞培养的生物反应器,用泵控制培养介质在反应器内循环。培养液在中空纤维腔内流动并通过中空纤维膜向另一侧供应细胞生长所需的养分。该反应器可控制溶氧、介质组成、温度和pH值,适合于细胞的高密度悬浮培养,尤其适合于动物细胞。
Gramer介绍了小型的中空纤维动物细胞培养反应器,由氧渗透膜管和中空纤维束构成内外空间,供细胞生长和向细胞提供营养。细胞培养密度几乎能达到2×108个/mL。该反应器可用于为大规模中空纤维培养系统预测不同介质、培养条件及其他因素对细胞生长可能产生的影响。
2.3 气升式生物反应器
气升式生物反应器(airlift bioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一,其特点是结构简单,操作方便。戴晓萍等人在气升式反应器中利用微载体培养技术,研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞,在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面,终密度可达1.13×106个/mL。
香港大学的Wen等人报道了一个新型的灌流装置,由气升式反应器和澄清器组成,用于高密度培养动物细胞。在灌流循环中,细胞经过两级沉降回到反应器,平均培养密度达到了1.31×107个/mL。
3 其他类型的反应器
除上述类型的反应器外,一些其他类型的适于动物细胞培养的生物反应器也时有报道。
Kleis等人设计了一个“粘性泵生物反应器”(viscous pump bioreactor),它以“三维流动”代替搅拌混合,提供较高的传质速率。反应器的底部是提供动力的流线型转盘,培养液在反应器中以水平运动和螺旋的纵向运动形成“三维流动”。由于转盘和反应器顶部都为流线型而没有锋利的边缘,所以产生的剪切力很小。
一篇美国专利介绍了一种膜式旋转细胞培养器,由一个培养室和一个供应室组成,中间隔有一层半透膜。营养物可以从供应室透过膜进入培养室,细胞代谢物也可以通过膜进入供应室。培养器中的混合装置在培养器旋转时保证细胞在培养室中温和混合并稳定悬浮。培养室与氧源之间的气体渗透膜使氧分能透过膜扩散溶于液相。该装置产生的剪切力很小,适合于细胞高密度地培养。另一篇美国专利介绍了一个组合式细胞培养器,带有膜的培养室插在供应室中,通过定位装置可以调节培养室的位置。该培养器适合于细胞或组织的培养。
Tsao发明了一个带有拱形培养室的细胞培养生物反应器,空气不与细胞直接接触,氧分通过气体渗透膜向培养介质中溶解。培养室可以绕轴旋转,拱形的结构减小了对细胞的剪切,尤其适合于动物细胞的培养。
陶祖莱等人发明了一个用于组织工程的双轴旋转式细胞/组织三维培养器,由内筒培养液流动室、细胞培养室和外筒气室的3个套筒组成,有利于细胞和组织三维生长及O2、CO2、营养物和代谢物的传递。他们还发明了一种可调控应力的旋转式细胞/组织三维培养器,也是三套筒结构。培养器内剪应力随着细胞聚集体的形成,可以从零调控至培养细胞或组织的生物应力。
Saha报道了一个新型的动物细胞培养反应器(“see-saw” bioreactor)。反应器由两个独立的筒状培养室构成,底部用管路联通。通过培养室顶部的三通阀在压缩和放空间切换,培养液在培养室间作类似“拉锯”的运动。由于粘性的作用,液面下降时液体在器壁上拉伸成膜,增大了与空气的接触面积,有利于氧的传递。实验在3种切换时间下(20s、25s、30s),溶解氧的实测值均比理论浓度高。反应器中没有搅拌和鼓泡的作用，所以对细胞的损伤很少。
此外,脉冲式生物反应器(pulsatile bioreactor)也是用在组织培养中的一种新型反应器。营养液通过脉冲灌流进入反应器,脉冲的频率和强度可调,借以模拟动物体内的生物应力。
4 结语
动物细胞培养的关键设备是细胞培养反应器,上面所介绍的几类都有各自的特点。但不论是改进的还是新型的,主要解决的共性问题都是要按照动物细胞的生长要求,使反应器具备低的剪切效应、良好的传递效果和流体力学性质。但在实际过程中,这些原则总有一些相互制约的因素,为了强化传递效果需要有一个充分的混合环境(包括气体鼓泡),但动物细胞的脆弱性制约了这个环境的形成;为提高培养介质中的溶氧度需要有较高的氧分压,不过,高的氧分压也影响了代谢物的移出。同时,过高的氧分压也影响细胞的正常生长。如何优化这些制约,是这类反应器开发中要解决的问题。在动物细胞培养中,反应器的改进大多针对搅拌式反应器。虽然这类反应器剪切力大,但由于它混合均匀、结构简单、操作方便以及良好的传递效果和操作弹性,在大规模细胞培养中仍占有重要的位置。
目前,研究工作要致力于开发高密度细胞培养反应器,提高细胞生产率或生物产物的浓度。尤其组织工程的迅速发展,对动物细胞生物反应器有了不同要求。要保持细胞离体培养时能具有同体内一样的三维异性结构、维持分化细胞的功能并支持细胞的高密度生长,培养过程要考虑种植有细胞的三维基质支架和生物反应器所组成的培养系统。事实上,一种反应器的开发不可能满足动物细胞生长的所有要求,同时也不可能适合所有的细胞培养方式。所以,根据某种细胞的培养过程或细胞的某种培养方式,开发专用反应器也许会比通用反应器有更好的效果。
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